PCR Vs Qpcr İlkeler ve Uygulamalardaki Anahtar Farklar

Genellikle biyolojik alanın "fotokopi makinesi" olarak tanımlanan gen amplifikasyon teknolojisi, hastalık teşhisinde, genetik araştırmasında ve diğer bilimsel alanlarda kilit rol oynamaktadır.Bu teknolojiler arasında, PCR ve qPCR ilk bakışta benzer görünür, ancak farklı amaçlara hizmet eder.ve özellikle araştırmacıların bilinçli kararlar almasına yardımcı olmak için veri analizi yaklaşımları.

Polymerase Zincir Reaksiyonu (PCR), spesifik DNA parçalarının amplifikasyonu için bir in vitro tekniğidir.PCR, hedef DNA dizilerini katlanarak artırmak için tekrarlanan ısıtma ve soğutma döngüleri kullanırTeknolojinin özü, hedef DNA'nın uçlarını tamamlayan ve DNA polimerazını belirli bölgelerin çoğaltılmasına yönlendiren kısa dizaynlarda yatıyor.

1. Denatürasyon:DNA örneğini (94-98°C) ısıtmak çift iplik DNA'yı tek ipliklere ayırır.
2. Dondurma:Sıcaklık azaltımı (50-65 ° C) primerlerin hedef dizilerine bağlanmasına izin verir.
3. Uzatma:Polimerazın optimal sıcaklığında (72°C), yeni DNA iplikleri primerlerden sentezlenir.

Bu döngülerin tekrarlanması hızla milyonlarca DNA kopyası üretir. PCR ürünleri tipik olarak parçaları boyutlarına göre ayıran agarose jel elektroforesi ile analiz edilir.

• Gen klonlaması:Rekombinant DNA yapısı için spesifik genleri amplifikasyon
• DNA dizimi:Yeterli DNA şablonu sağlamak
• Hastalık teşhisi:Patogenlerin veya genetik mutasyonların tespiti
• Adli tıp:DNA parmak izleri

Kvantitatif PCR (qPCR) veya gerçek zamanlı PCR, doğru bir miktarlamayı sağlayan gerçek zamanlı olarak DNA amplifikasyonunu izleyen gelişmiş bir sürümü temsil eder.Bu teknoloji, DNA konsantrasyonu ile ilişkili olan floresan belirteçler kullanıyor..

• Floresan boyalar:SYBR Yeşil, çift ipli DNA'ya bağlanır, amplifikasyon sırasında floresans artar.
• Floresan sondası:Daha pahalı ama son derece spesifik olan, sadece hedeflere bağlandığında floresans yayan dizgi özel problar.

Kvantitasyon, eşik döngüsü (Ct) değerine (fluoresans arkaplanı aştığında döngü numarası) dayanır. Daha düşük Ct değerleri daha yüksek başlangıç DNA konsantrasyonlarını gösterir. Analiz yöntemleri şunları içerir:

• Niteliksel ölçüm:Normalleşme için referans genleri kullanarak örnekler arasındaki hedef gen ekspresyonunun karşılaştırılması
• Mutlak ölçüm:Bilinen konsantrasyonlardan standart eğri kullanılarak tam DNA kopyası sayısını belirlemek

• Gen ekspresyonu analizi:MRNA seviyelerinin ölçümü
• Patogen tespiti:Virüs/bakteri yüklerinin ölçülmesi
• İlaç geliştirme:Gen ekspresyonu üzerindeki farmakolojik etkileri değerlendirmek
• Kanser araştırması:Tümör biyomarkerlerinin tespiti

Ters Transkripsiyon PCR (RT-PCR), RNA'yı daha sonra amplifikasyon için tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) dönüştürür ve RNA'nın tespit edilmesini sağlar.

• Tek aşamalı RT-PCR:Tek bir tüpte ters transkripsiyon ve PCR'yi birleştirir.
• İki aşamalı RT-PCR:Reaksiyonları sırayla gerçekleştirir.

RT-PCR'yi qPCR ile birleştirmek, gen ekspresyonu çalışmalarında mRNA miktarlandırması için altın standart olan RT-qPCR'yi yaratır.

PCR analizi, bant yoğunluğu ile varlığı/yokluğunu ve göreceli bolluğunu gösteren DNA bantlarının basit jel görselleştirmesini içerir.

qPCR analizi, Ct değerleri yoluyla karmaşık bir miktarlamayı sağlar ve şunları gerektirir:

• Arka plan floresansını hesaba katmak için başlangıç düzeltmesi
• Ct'nin doğru belirlenmesi için hassas bir eşik ayarlaması
• Amplifikasyon özelliğini doğrulamak için erime eğrisi analizi

Göreceli ölçüm için, uygun referans gen seçimi ve normalleştirme çok önemlidir, mutlak ölçüm ise yüksek kaliteli standart eğriler gerektirir.

PCR ve qPCR arasında seçim, araştırma hedeflerine bağlıdır:

• Gen ekspresyonu:RT-qPCR
• Patogen tespiti:qPCR
• Gen klonlaması:PCR
• DNA dizimi:PCR

Varlık/yokluğu tespit etmek için PCR yeterlidirken, kesin miktarlama gereksinimleri için qPCR gereklidir.