Blog Hakkında Nükleik asit ekstraksiyon kitleri için temel ilkeler ve sorun giderme

Nükleik asit ekstraksiyonu moleküler biyoloji deneylerinin temel taşıdır.Birçok araştırmacı kendini şaşkın buldu.Özellikle beklenmedik sonuçları giderirken. This article demystifies the scientific principles underlying nucleic acid extraction kits while providing practical troubleshooting guidance to transform this essential technique from a "black box" operation into a predictable, verimli bir süreç.

Çoğu ticari nükleik asit ekstraksiyon seti, beş kritik aşamaya sahip silik membran spin sütunu teknolojisini kullanır: hücre lizisi, nükleik asit bağlanması, yıkama ve arıtma, kurutma,ve son elusiyonHer adım önceki aşamaya dayanıyor, yani yanlış bir adım tüm çıkarmayı tehlikeye atabilir.

Etkili hücre lizisi, çok önemli ilk adımı temsil eder.ama tipik olarak ikili amaçlar için yüksek konsantrasyonda kaotrop tuzlar içerir:

• Protein denatürasyonu:Bu tuzlar hidrojen bağlarını, van der Waals kuvvetlerini ve hidrofobic etkileşimleri bozar, nükleik asit bozulmasını önlemek için proteinleri (nükleazlar dahil) istikrarsızlaştırır.
• Silika bağlanmasını kolaylaştıran:Kaotroplar su moleküllerini nükleik asitlerden yer değiştirerek, silik membranlara aktarmak için optimal koşullar yaratır.

Yaygın kaotrop tuzlar arasında guanidin hidroklorürü, guanidin tiyosyanatı, üre ve lityum perklorat bulunur.Örnek türüne bağlı olarak, enzimler de dahil edilebilir. Proteinase K, özellikle denatürasyon koşullarında, nükleik asit preparatlarındaki proteinleri etkili bir şekilde sindirir.Denizlenme koşullarında etkinliği azalsa da..

Plasmid ekstraksiyonu, RNA veya genomik DNA izolasyonundan önemli ölçüde farklıdır.Kaotropik tuzları hemen eklemek tüm DNA türlerini ayrım yapmadan serbest bırakır.Bu nedenle, plazmid protokolleri genellikle ilk hücre lizisinden sonra kaotropları tanıtır.

Lizin ötesinde, kaotrop tuzlar nükleik asitlerin silik sütunlara bağlanmasını kolaylaştırır.Silika sütunları, tuz konsantrasyonuna ve diğer faktörlere bağlı olarak DNA veya RNA'ya seçici olarak bağlanan reçine içerirSonuçta elde edilen nükleik asitler klonlama, uzun okuma dizimi ve diğer uygulamalar için uygun yüksek saflık göstermektedir.

Etanol konsantrasyonu kritik olarak ortaya çıkıyor. Aşırı etanol bozulmuş malzeme ve küçük molekülleri yağdırıyor ve A260 emilim değerlerini etkiler.Yetersiz etanol, zarlardan tuz çıkarılmasını engelleyebilirKitle sağlanan etanol hacimleri önceden optimize edilir, ancak bozulmuş DNA A260 okumalarını çarpıtıyorsa, etanol konsantrasyonunun yeniden optimize edilmesi yardımcı olabilir.Kayıp nükleik asitleri geri kazanmak için akış yoluyla çözeltiler yağış için kaydedilebilirLizyde SDS içeren deterjanlar kullanıldığında, NaCl deterjan kirliliğini önleyen etkili bir yağlayıcı olarak hizmet eder.

Lizatın silik membranlar üzerinden santrifüj edilmesinden sonra, hedef nükleik asitler sütunlara bağlanırken, proteinler ve polisakaritler akışta kalır.Membranlar kalıntı proteinleri ve tuzları korur.Bitki örnekleri polisakaritler ve pigmentler bırakabilir; kan örnekleri genellikle kahverengi veya sarı renk değişimi meydana getirir.

İki yıkama tipiktir, ancak kesin sayıları numune türüne bağlıdır.sonra tuzları ortadan kaldırmak için etanol yıkamalarıBaşlangıçta az proteinli örnekler (örneğin, plazmid hazırlamaları veya PCR ürünü arıtma) sadece etanol yıkama gerektirebilir.Bazı kitler iki kat etanol yıkama önerir.Kalan tuzlar elusiyonu engeller, verimleri azaltır ve A230 oranlarını düşüren A260/230 okumalarını arttırır.

Çoğu protokol, sütunlardan kalan etanolün kurutulması için yıkama sonrası santrifüjasyonu içerir.10 mM Tris tamponu veya suyu ekleyerek, membran serbest bırakmak için nükleik asitleri yeniden hidratlar.Kalan etanol, tamamen rehidrasyonu ve elusiyonu engeller.belirtiler, örneklerin agarose jel kuyularına yerleşememesini (yarıtma boyaları bile mevcut olsa) veya -20 °C'de donamamasını içerir..

DNA ekstraksiyonunun son adımı, silikadan saf nükleik asitler serbest bırakır. DNA için pH 8-9'da 10 mM Tris standarttır.DNA zayıf alkali pH'da daha istikrarlı kalır ve suya göre tamponda daha hızlı çözülür. DNA çökeltileri bile benzer şekilde davranır. Su tipik olarak daha düşük pH (4-5) gösterir ve yüksek moleküler ağırlık DNA'nın hızlı bir şekilde tamamen yeniden hidratlanmaması mümkündür.Merkeze çekilmeden önce tampon membranlarda birkaç dakika otursun.Sağlam yüksek moleküler ağırlıklı DNA gerektiren uygulamalar için (örneğin, uzun okuma dizimi), elusiyon tamponları en iyisidir. RNA zayıf asidik pH'ya tolerans gösterir ve suda kolayca çözülür.Suyu tercih edilen seyrelticinin haline getirmek.

Standart protokolleri takip ederken bile, çıkarma çeşitli sorunlarla karşılaşabilir:

• Düşük verim:Genellikle eksik lizis veya optimum olmayan bağlanma koşullarından kaynaklanır.Kötü kaliteli veya eski etanol nem emiyor olabilirHatırlayın, yanlış hazırlanmış yıkama tamponları çıkarılan nükleik asitleri çekebilir!
• Düşük saflık:Protein kirliliği genellikle eksik çözünme riskini artıran aşırı başlangıç malzemesinden kaynaklanır. Düşük A260/230 oranları tipik olarak kalıntı tuzları veya yetersiz yıkama gösterir.Yıkama tamponları için en kaliteli etanol kullanın, ve sorunlar devam ederse, ekstra yıkama adımları ekleyin.
• Kirletici maddeler:Çevre numuneleri, DNA ile birlikte arıtılan ve silikon sütununun çıkarılmasına direnç gösteren humik maddelere karşı özellikle duyarlı olduğunu kanıtlar.Özel teknikler, sütun bağlanmadan önce müdahale eden proteinleri ve humikleri kaldırabilir.
• Bozulma:RNA, tipik olarak uygun olmayan numune depolanması veya verimsiz lizisden (RNase içermeyen su kullanıldığını varsayarsak) daha büyük bozulma riskleriyle karşı karşıyadır.Degradasyon PCR uygulamaları için daha az önemlidir, ancak sağlam yüksek moleküler ağırlıklı DNA gerektiren uzun okuma dizimi için kritik hale gelir!
• PCR ürününün arıtılması:DNA ekstraksiyonu olmadığı halde, bu özellikle değinilmeye değer. Tipik olarak, spin sütunu arıtmadan önce PCR reaksiyon hacmi başına 3-5 hacim tuz çözeltisi eklenir.Başarısız arıtmalar genellikle başarısız PCR'den kaynaklanır., ancak akıştan tasarruf etmek akıllıca bir davranıştır. Eğer açık PCR bantları sütunlara bağlanmazsa, muhtemelen geri kazanma ve yeniden arındırma için akışta kalırlar.

Eksik lizis beklenmedik şekilde düşük verim, eksik protein çözünmesi veya zayıf A260/230 oranları olarak ortaya çıkabilir.Bu, bazı örnek bileşenlerinin ekstraksiyon sırasında tamamen lize olamadığını veya çözülmediğini göstermektedir.Eksik lizi kontaminasyondan veya bozulmadan ayırt etmek, lizi tampon kompozisyonu, inkubasyon parametreleri,ve potansiyel engelleyici maddelerÖrneğin, zayıf A260/230 oranları, eksik lizi yerine bağlanmadan sonraki kalıntı tuzları veya yetersiz yıkamayı gösterebilir.Eksik lizi ele almak, lizi tampon bileşenlerini optimize etmeyi gerektirebilir., inkubasyon süreleri veya ek mekanik/enzimatik lizis yöntemleri içerir.

Uzman teknikler, çevresel numunelerden nükleik asitlerle birlikte arındırılabilecek humik maddelerin ve diğer müdahalecilerin çıkarılmasını hedefler.Bunlara, kelatör maddeler içeren özel ekstraksiyon tamponları (e.g., EDTA) katyonları seçici olarak bağlamak ve çıkarmak için.Farklı santrifüj veya filtreleme gibi ön işleme yöntemleri, nükleik asit ekstraksiyonundan önce çevresel örneklerden daha büyük parçacıkları çıkarmaya yardımcı olabilir., bağlama aşamalarında karışımı azaltır.

Belirli örnekler (örneğin dokular veya lipit bakımından zengin malzemeler) özel zorluklar ortaya koyar.Doku örnekleri genellikle tam lizis ve nükleik asit salınımını sağlamak için ek mekanik bozulma veya enzimatik sindirim gerektirir.. Lipit bakımından zengin örnekler, lipitlerin sütun matrislerine bağlanan nükleik asitlere müdahale edebileceği için arıtmayı karmaşıklaştırabilir.Temizleme protokollerinin optimize edilmesi, ya da özel olarak tasarlanmış kitler kullanarak.

Başlangıçta 28 Haziran 2010'da yayınlandı.