PCR, RTPCR ve Qpcr Tekniklerine İlişkin Açıklamalı Kılavuz

Laboratuvarda "PCR", "RT-PCR" ve "qPCR" terimleri hiç kafanızı karıştırdı mı? Endişelenmeyin; bu makale, bu teknikler arasındaki farkları basit terimlerle açık bir şekilde açıklayacak ve araştırmanızı daha etkili bir şekilde yönlendirmenize yardımcı olacaktır.

PCR veya Polimeraz Zincir Reaksiyonu, bir DNA "fotokopi makinesi" gibi işlev görür. Kary Mullis tarafından icat edilen bu temel moleküler biyoloji tekniği, hedef DNA dizilerini in vitro olarak hızla çoğaltarak saatler içinde milyonlarca ila milyarlarca kopya üretiyor. PCR, gen klonlaması, DNA dizilimi, hastalık teşhisi ve diğer birçok uygulama için gereklidir.

PCR işlemi, üstel DNA amplifikasyonunu mümkün kılan üç tekrar eden adımdan oluşur:

1. Denatürasyon:Yüksek sıcaklık (94-98°C) çift sarmallı DNA'yı tek sarmallara ayırır.
2. Tavlama:Sıcaklığın düşürülmesi (50-65°C), primerlerin tamamlayıcı hedef dizilere bağlanmasına olanak tanır.
3. Eklenti:DNA polimeraz (tipik olarak Taq polimeraz), 72°C'de yeni tamamlayıcı iplikleri sentezler.

25-40 döngüden sonra amplifiye DNA, agaroz jel elektroforezi kullanılarak görüntülenebilir.

Kantitatif PCR (qPCR) veya Gerçek Zamanlı PCR, başlangıçtaki DNA şablonu miktarını ölçerken amplifikasyonu gerçek zamanlı olarak izlemek için floresans tespitini dahil ederek geleneksel PCR'yi temel alır.

İki temel floresans tespit yöntemi mevcuttur:

• DNA bağlayıcı boyalar (örn. SYBR Green):Uygun maliyetlidir ancak spesifik değildir, çift sarmallı DNA'nın tamamını bağlar.
• Floresan problar:Hedefe özel ancak daha pahalıdır ve özel olarak tasarlanmış problar gerektirir.

Anahtar qPCR ölçümü Ct (eşik döngüsü) değeridir; floresans tanımlanmış bir eşiği aştığında döngü numarasıdır. Daha düşük Ct değerleri, daha yüksek başlangıç ​​şablon konsantrasyonlarını gösterir.

Uygulamalar şunları içerir:

• Gen ekspresyonu analizi
• Patojen tespiti
• İlaç taraması
• Kanser araştırması

Ters Transkripsiyon PCR (RT-PCR), önce ters transkriptaz kullanarak RNA'yı tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) dönüştürür, ardından standart PCR yoluyla cDNA'yı güçlendirir. Bu, aşağıdakileri içeren RNA analizini mümkün kılar:

• Gen ekspresyonu çalışmaları
• RNA virüsü tespiti (örn. HIV, grip)
• RNA yapısı/fonksiyonu araştırması

Gerçek Zamanlı Kantitatif RT-PCR, RNA ekspresyon seviyelerini ölçmek için ters transkripsiyonu qPCR ile birleştirir. Bu altın standart yöntem yaygın olarak aşağıdaki amaçlarla kullanılır:

• Hassas gen ekspresyonu ölçümü
• mikroRNA ölçümü
• Uzun kodlayıcı olmayan RNA çalışmaları

qPCR, özgüllüğü sağlamak için dikkatle tasarlanmış primerler ve problar gerektirir. Uyumsuzluklar yanlış sonuçlara yol açabilir.

Farklı enzimler (örn. AMV, M-MLV) termal stabilite ve verimlilik açısından farklılık göstererek cDNA verimini etkiler.

Spesifik olmayan amplifikasyon, optimize edilmiş tavlama sıcaklıkları ve yüksek kaliteli polimerazlar aracılığıyla en aza indirilebilir.

Bu moleküler tekniklerin farklılıklarını anlamak, araştırmacıların kendi spesifik deneysel ihtiyaçları için uygun yöntemleri seçmelerine, doğru ve güvenilir sonuçlar elde etmelerine olanak tanır.