RTPCR Test İlkeleri Yorumu ve COVID19 Riski

COVID-19 pandemisi küresel zorluklar sunmaya devam ederken, RT-PCR (Ters Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu) testi, SARS-CoV-2 enfeksiyonunu teşhis etmek için altın standart olmaya devam ediyor. Ancak, bu önemli teşhis aracının arkasındaki bilimsel ilkeleri gerçekten kaç kişi anlıyor? Bu makale, hem tıp uzmanlarının hem de genel halkın bu hayati teknolojiyi daha iyi anlamasına yardımcı olarak, RT-PCR testinin derinlemesine ancak erişilebilir bir açıklamasını sunmaktadır.

RT-PCR veya Gerçek Zamanlı Ters Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu, numunelerdeki belirli genetik materyali tespit etmek için kullanılan, oldukça hassas ve hızlı bir moleküler biyoloji tekniğidir. Bu genetik materyal, insanlardan, bakterilerden veya SARS-CoV-2 gibi virüslerden kaynaklanabilir.

RT-PCR'nin arkasındaki temel teknoloji, 1980'lerde Kary B. Mullis tarafından icat edilen (Nobel Ödülü kazandıran) PCR'dir. PCR, belirli DNA hedeflerini çoğaltır ve tespit eder. Daha sonraki iyileştirmeler, amplifikasyon sırasında DNA hedeflerinin "gerçek zamanlı" görselleştirilmesini ve miktarının belirlenmesini sağladı. Gerçek zamanlı PCR'de, özel problardan gelen floresan yoğunluğu, çoğaltılan DNA miktarıyla ilişkilidir.

Ancak, standart PCR yalnızca DNA'yı tespit eder. SARS-CoV-2 RNA genetik materyali içerdiğinden, testin RNA'yı tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) dönüştürmek için ters transkriptaz enzimine ihtiyacı vardır. Bu ters transkripsiyon adımı, gerçek zamanlı PCR ile birleştirildiğinde, RT-PCR'yi SARS-CoV-2 gibi RNA virüslerini tespit etmek için güçlü bir araç haline getirir.

RT-PCR'yi anlamak, hücresel ve viral davranışı, hayatta kalmayı ve üremeyi yöneten talimat kılavuzu olan genetik materyalin temel bilgisini gerektirir. Genetik materyal iki ana formda gelir: DNA (deoksiribonükleik asit) ve RNA (ribonükleik asit). DNA çift sarmallı bir yapıya sahipken, RNA tek sarmallıdır. Teşhis amaçları için, DNA'nın daha fazla kararlılığı, onu bulaşıcı hastalık testleri için tercih edilir hale getirir. Özellikle, SARS-CoV-2 yalnızca RNA içerir.

Tüm virüsler, hayatta kalmak ve çoğalmak için konakçı hücrelere bağımlı olma özelliğini paylaşır. SARS-CoV-2, diğer virüsler gibi, çoğalmak için sağlıklı hücreleri istila eder. Enfeksiyon meydana geldiğinde, virüs RNA'sını serbest bırakır ve çoğalma için hücresel makineleri ele geçirir. Viral genetik materyal hücrelerde kaldığı sürece, RT-PCR SARS-CoV-2 enfeksiyonunu tespit edebilir.

Eğitimli sağlık çalışanları, daha sonra viral bütünlüğü korumak için viral taşıma ortamı içeren steril tüplere yerleştirilen nazofarengeal sürüntü numuneleri toplar.

Laboratuvarda, araştırmacılar ticari saflaştırma kitleri kullanarak RNA'yı ekstrakte ederler. Daha sonra RNA numunesi, DNA polimeraz, ters transkriptaz, DNA yapı taşları ve SARS-CoV-2'ye özgü floresan problar ve primerler dahil olmak üzere test için gerekli tüm bileşenleri içeren bir reaksiyon karışımına eklenir.

PCR yalnızca DNA şablonlarıyla çalıştığından, ters transkriptaz, numunedeki tüm RNA'yı (insan, bakteriyel, diğer koronavirüs RNA'sı ve potansiyel olarak SARS-CoV-2 RNA'sı dahil) cDNA'ya dönüştürür.

Bu işlem üç tekrarlayan adımdan oluşur:

• Denatürasyon: DNA'yı yaklaşık 10 dakika boyunca >90°C'ye ısıtmak, çift sarmallı DNA'yı tek sarmallara ayırır.
• Primer Bağlanması: Özel olarak tasarlanmış kısa DNA parçaları (primerler), daha düşük sıcaklıklarda belirli SARS-CoV-2 cDNA hedeflerine bağlanır. Yaygın COVID-19 gen hedefleri arasında RNA'ya bağımlı RNA polimeraz (RdRP), ORF1ab, S geni (diken proteini), N geni (nükleokapsid) ve E geni (zarf) bulunur.
• Uzatma: DNA polimeraz, hedef DNA segmentlerinin özdeş kopyalarını oluşturmak için primerleri başlangıç noktası olarak kullanır.

İşlem tipik olarak 40 kez tekrarlanır ve her döngüde hedef DNA ikiye katlanır. Floresan problar, primerlerin aşağısına bağlanır ve her DNA amplifikasyonu ile tespit edilebilir sinyaller yayar. Artan hedef DNA, artan floresan yoğunluğu ile ilişkilidir.

Floresan verileri, sinyalin arka plan seviyelerini aşması için gereken döngü sayısı olan bir "Döngü Eşiği" (Ct) değeri oluşturur. Daha fazla hedef DNA'ya sahip numuneler daha hızlı amplifiye olur ve daha az döngü (daha düşük Ct değerleri) gerektirir. Tersine, kıt hedef DNA daha fazla döngü (daha yüksek Ct değerleri) gerektirir.

Ct değerleri, viral yük hakkında çok önemli bilgiler sağlar. Daha düşük Ct değerleri daha yüksek viral genom miktarlarını gösterirken, daha yüksek değerler daha düşük miktarları gösterir. Sağlık hizmeti sağlayıcıları, hastalık evresini değerlendirmek için Ct değerlerini klinik semptomlar ve geçmişle birleştirir. Tekrarlanan testlerden elde edilen seri Ct değerleri, hastalığın ilerlemesini izlemeye ve iyileşmeyi tahmin etmeye yardımcı olur. İletişim izleyiciler ayrıca, en yüksek viral yüklere (ve dolayısıyla en büyük bulaşma riskine) sahip hastaları önceliklendirmek için Ct değerlerini kullanır.

• Viral Yük: Ct değerleri, viral yük ile ters orantılıdır; daha düşük Ct, daha fazla virüsün mevcut olduğu anlamına gelir.
• Hastalık Evresi: Erken enfeksiyon tipik olarak yüksek viral yükler (düşük Ct) gösterirken, sonraki evreler, bağışıklık sistemi enfeksiyonu temizledikçe azalan yükleri (yükselen Ct) gösterir.
• Bulaşma Riski: Daha yüksek viral yükler (daha düşük Ct değerleri), daha büyük bulaşma potansiyelini gösterir ve daha sıkı izolasyon önlemleri gerektirir.

COVID-19'un teşhis altın standardı olmasına rağmen, RT-PCR'nin sınırlamaları vardır:

• Yanlış Negatifler: Yanlış numune alma, düşük viral yükler veya erken test, gerçek enfeksiyona rağmen negatif sonuçlar üretebilir.
• Yanlış Pozitifler: Nadir görülen ancak olası, gerçek enfeksiyon olmadan pozitif sonuçlar.
• Standardizasyon Zorlukları: Farklı laboratuvarlar ve platformlar, karşılaştırmaları karmaşıklaştıran farklı Ct eşikleri kullanabilir.

RT-PCR testi, SARS-CoV-2 genetik materyalini tespit ederek COVID-19 teşhisi için temel olmaya devam etmektedir. Ct değerleri, viral yük, hastalık ilerlemesi ve bulaşma riskinin hayati göstergeleri olarak hizmet eder. Ancak, test sınırlamaları, doğru teşhis ve yönetim için sonuçların klinik değerlendirme ile birleştirilmesini gerektirir.